化妝品微生物檢驗(yàn)

一、總  則

1  范圍

    本規(guī)范規(guī)定了微生物檢驗(yàn)總則。

　　本規(guī)范適用于化妝品樣品的采集、保存、供檢樣品制備。

2  儀器和設(shè)備

2.1 天平。

2.2 高壓滅菌器。

2.3 三角瓶。

2.4 玻璃珠。

2.5 玻璃棒。   

2.6 刻度吸管。

2.7 研缽。

2.8 均質(zhì)器。

2.9 恒溫水浴箱。  

2.10 采樣用具：不銹鋼勺，剪刀，開(kāi)罐器等。

3  培養(yǎng)基和試劑

3.1 生理鹽水

    成分：氯化鈉 8.5g

          蒸餾水加至 1000 mL

    溶解后，分裝到加玻璃珠的三角瓶?jī)?nèi)，每瓶90mL，103.43kPa(15 lb)20min高壓滅菌。

3.2  營(yíng)養(yǎng)瓊脂

     成分：  營(yíng)養(yǎng)瓊脂 33g

             蒸餾水 1000mL

    制法：先將營(yíng)養(yǎng)瓊脂在蒸餾水中加溫溶解后分裝，103.43kPa(15lb)20min高壓滅菌。冷卻至45℃～50℃左右使用。

3.3  滅菌液體石蠟。

3.4 滅菌吐溫80。

4  樣品的采集及注意事項(xiàng)

4.1  所采集的樣品，應(yīng)具有代表性，一般視每批化妝品數(shù)量大小，隨機(jī)抽取相應(yīng)數(shù)量的包裝單位。檢驗(yàn)時(shí)，應(yīng)分別從兩個(gè)包裝單位以上的樣品中共取10g或10mL。包裝量小于20g的樣品，采樣量應(yīng)適量增加，其總量應(yīng)大于16g。

4.2  供檢驗(yàn)樣品，應(yīng)嚴(yán)格保持原有的包裝狀態(tài)，進(jìn)口產(chǎn)品應(yīng)為市售包裝。容器不應(yīng)有破裂，在檢驗(yàn)前不得打開(kāi)，防止樣品被污染。

4.3  接到樣品后，應(yīng)立即登記，并按檢驗(yàn)要求盡快檢驗(yàn)。如不能及時(shí)檢驗(yàn)，樣品應(yīng)放在室溫陰涼干燥處，不要冷藏或冷凍。

4.4  若只有一份樣品而同時(shí)需做多種分析，如微生物、毒理、化學(xué)等，應(yīng)先做微生物檢驗(yàn)，再將剩余樣品做其它分析。

4.5  在檢驗(yàn)過(guò)程中，從打開(kāi)包裝到全部檢驗(yàn)操作結(jié)束，均須防止微生物的再污染和擴(kuò)散，所用采樣用具、器皿及材料均應(yīng)事先滅菌，全部操作應(yīng)在無(wú)菌室內(nèi)進(jìn)行，或在相應(yīng)條件下，按無(wú)菌操作規(guī)定進(jìn)行。

5  供檢樣品的制備

5.1 液體樣品

5.1.1  水溶性的液體樣品，量取10mL加到90mL滅菌生理鹽水中，混勻后，制成1:10檢液。

5.1.2  油性液體樣品，取樣品10mL，先加5mL滅菌液體石蠟混勻，再加10mL滅菌的吐溫80，在40℃～44℃水浴中振蕩混合10min，加入滅菌的生理鹽水75mL(在40℃～44℃水浴中預(yù)溫)，在40℃～44℃水浴中乳化，制成1:10的懸液。

5.2  膏、霜、乳劑半固體狀樣品

5.2.1 親水性的樣品，稱取10g，加到裝有玻璃珠及90mL滅菌生理鹽水的三角瓶中，充分振蕩混勻，靜置15min。取其上清液作為1:10的檢液。

5.2.2  疏水性樣品，稱取10g，放到滅菌的研缽中，加10mL滅菌液體石蠟，研磨成粘稠狀，再加入10mL滅菌吐溫80，研磨待溶解后，加70mL滅菌生理鹽水，在40℃～44℃水浴中充分混合，制成1:10檢液。

5.3  固體樣品，稱取10g，加到90mL滅菌生理鹽水中，充分振蕩混勻，使其分散混懸，靜置后，取上清液作為1:10的檢液。

如有均質(zhì)器，上述水溶性膏、霜、粉劑等，可稱10g樣品加入90mL滅菌生理鹽水，均質(zhì)1min～2min；疏水性膏、霜及眉筆、口紅等，稱10g樣品，加10mL滅菌液體石蠟，10mL滅菌吐溫80，70mL滅菌生理鹽水，均質(zhì)3min～5min。

二、菌落總數(shù)

Aerobic Bacterial Count

1  范圍

    本規(guī)范規(guī)定了化妝品中菌落總數(shù)的檢驗(yàn)方法。

　　本規(guī)范適用于化妝品菌落總數(shù)的測(cè)定。

2　定義

    本規(guī)范采用下列定義

　　菌落總數(shù)(aerobic bacterial count)是指化妝品檢樣經(jīng)過(guò)處理，在一定條件下培養(yǎng)后(如培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間、pH值、需氧性質(zhì)等)，1g(1mL)檢樣中所含菌落的總數(shù)。所得結(jié)果只包括一群本方法規(guī)定的條件下生長(zhǎng)的嗜中溫的需氧性菌落總數(shù)。

    測(cè)定菌落總數(shù)便于判明樣品被細(xì)菌污染的程度，是對(duì)樣品進(jìn)行衛(wèi)生學(xué)總評(píng)價(jià)的綜合依據(jù)。

3  儀器和設(shè)備

3.1  三角瓶。

3.2  量筒。

3.3  pH計(jì)或精密pH試紙。

3.4  高壓滅菌器。

3.5  試管。

3.6  平皿： 直徑9cm。

3.7  刻度吸管： 10mL、2mL、1mL。

3.8  酒精燈。

3.9  恒溫培養(yǎng)箱。

4 培養(yǎng)基和試劑

4.1    生理鹽水：見(jiàn)總則中3.1。

4.2   營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基

4.2.1  成分：  營(yíng)養(yǎng)瓊脂 33g

               蒸餾水 1000mL

4.2.2  制法：先將營(yíng)養(yǎng)瓊脂加到蒸餾水中，加熱溶解，103.43kPa(15 lb)20min高壓滅菌，儲(chǔ)存于冷暗處備用。

5  操作步驟

5.1  用滅菌吸管吸取1:10稀釋的檢液2mL，分別注入到兩個(gè)滅菌平皿內(nèi)，每皿1mL。另取1mL注入到9mL滅菌生理鹽水試管中(注意勿使吸管接觸液面)，更換

一支吸管，并充分混勻，制成1:100檢液。吸取2mL，分別注入到兩個(gè)滅菌平皿內(nèi)，每皿1mL。如樣品含菌量高，還可再稀釋成1:1000，1:10000，……等，每種稀釋度應(yīng)換1支吸管。

5.2  將融化并冷至45℃～50℃的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基傾注到平皿內(nèi)，每皿約15mL，隨即轉(zhuǎn)動(dòng)平皿，使樣品與培養(yǎng)基充分混合均勻，待瓊脂凝固后，翻轉(zhuǎn)平皿，置37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48h。另取一個(gè)不加樣品的滅菌空平皿，加入約15mL卵磷脂吐溫80營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，待瓊脂凝固后，翻轉(zhuǎn)平皿，置37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48h，為空白對(duì)照。

6  菌落計(jì)數(shù)方法

用肉眼觀察，點(diǎn)數(shù)菌落數(shù)。記下各平皿的菌落數(shù)后，求出同一稀釋度各平皿生長(zhǎng)的平均菌落數(shù)。若平皿中有連成片狀的菌落或花點(diǎn)樣菌落蔓延生長(zhǎng)時(shí)，該平皿不宜計(jì)數(shù)。若片狀菌落不到平皿中的一半，而其余一半中菌落數(shù)分布又很均勻，則可將此半個(gè)平皿菌落計(jì)數(shù)后乘以2，以代表全皿菌落數(shù)。

7  菌落計(jì)數(shù)及報(bào)告方法

7.1  首先選取平均菌落數(shù)在30～300個(gè)之間的平皿，作為菌落總數(shù)測(cè)定的范圍。當(dāng)只有一個(gè)稀釋度的平均菌落數(shù)符合此范圍時(shí)，即以該平皿菌落數(shù)乘其稀釋倍數(shù)(見(jiàn)表1中例1)。

7.2  若有兩個(gè)稀釋度，其平均菌落數(shù)均在30～300個(gè)之間，則應(yīng)求出兩菌落總數(shù)之比值來(lái)決定，若其比值小于或等于2，應(yīng)報(bào)告其平均數(shù)，若大于2則報(bào)告其中稀釋度較低的平皿的菌落數(shù)(見(jiàn)表1中例2及例3)。

7.3  若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均大于300個(gè)，則應(yīng)按稀釋度最高的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告之(見(jiàn)表1中例4)。

7.4  若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均小于30個(gè)，則應(yīng)按稀釋度最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告之(見(jiàn)表1例5)。

7.5  若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均不在30～300個(gè)之間，其中一個(gè)稀釋度大于300個(gè)，而相鄰的另一稀釋度小于30個(gè)時(shí)，則以接近30或300的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告之(見(jiàn)表1中例6)。

7.6  若所有的稀釋度均無(wú)菌生長(zhǎng)，報(bào)告數(shù)為每g或每mL小于10CFU。

7.7  菌落計(jì)數(shù)的報(bào)告，菌落數(shù)在10以內(nèi)時(shí)，按實(shí)有數(shù)值報(bào)告之，大于100時(shí)，采用二位有效數(shù)字，在二位有效數(shù)字后面的數(shù)值，應(yīng)以四舍五入法計(jì)算。為了縮短數(shù)字后面零的個(gè)數(shù)，可用10的指數(shù)來(lái)表示(見(jiàn)表1報(bào)告方式欄)。在報(bào)告菌落數(shù)為“不可計(jì)”時(shí)，應(yīng)注明樣品的稀釋度。  

表1   菌落計(jì)數(shù)結(jié)果及報(bào)告方式

     ＊CFU：菌落形成單位。

三、霉菌和酵母菌

1  范圍

    本規(guī)范規(guī)定了化妝品中霉菌和酵母菌數(shù)的檢測(cè)方法。

　　本規(guī)范適用于各種化妝品中霉菌和酵母菌的總數(shù)測(cè)定。

2 定義

　　本規(guī)范采用下列定義。

    霉菌和酵母菌總數(shù)是指化妝品檢樣在一定條件下培養(yǎng)后，1g或1mL化妝品中所污染的活的霉菌和酵母菌菌落總數(shù)，藉以判明化妝品被霉菌和酵母菌污染程度及其一般衛(wèi)生狀況。

    本方法根據(jù)霉菌和酵母菌特有的形態(tài)和培養(yǎng)特性，在虎紅培養(yǎng)基上，置28℃培養(yǎng)120h，計(jì)算所生長(zhǎng)的霉菌和酵母菌數(shù)。

3  儀器和設(shè)備

3.1  恒溫霉菌培養(yǎng)箱：28℃。

3.2  高壓滅菌器。

3.3  天平。

3.4  三角瓶。

3.5  試管。

3.6  試管架。

3.7  平皿：直徑90mm。

3.8  刻度吸管：1mL、2mL、10mL。

3.9  量筒。

3.10  酒精燈。

4  培養(yǎng)基和試劑

4.1  生理鹽水  見(jiàn)總則中3.1。

4.2  虎紅(孟加拉紅)培養(yǎng)基

    成分：虎紅瓊脂                    31.6g

           蒸餾水                     1000mL

    制法： 將虎紅瓊脂加入蒸餾水中溶解。分裝后，103.43kPa(15 lb)20min高壓滅菌。

5  操作步驟

5.1  樣品稀釋 見(jiàn)菌落總數(shù)測(cè)定中6.1。

5.2  取1:10的檢液2mL分別注入2個(gè)滅菌平皿內(nèi)，每皿1mL（若菌量較多時(shí)可順序再做10倍稀釋），另取1個(gè)滅菌空平皿（作空白對(duì)照），每皿分別注入融化并冷至45℃左右的虎紅培養(yǎng)基約15mL，充分搖勻。凝固后，翻轉(zhuǎn)平板，置28℃培養(yǎng)箱，培養(yǎng)120h，計(jì)數(shù)平板內(nèi)生長(zhǎng)的霉菌和酵母菌數(shù)。若有霉菌蔓延生長(zhǎng)，為避免影響其它霉菌和酵母菌的計(jì)數(shù)時(shí)，于48h應(yīng)及時(shí)將此平板取出計(jì)數(shù)。    

5.3  計(jì)算方法：先點(diǎn)數(shù)每個(gè)平板上生長(zhǎng)的霉菌和酵母菌菌落數(shù)，求出每個(gè)稀釋度的平均菌落數(shù)。判定結(jié)果時(shí)，應(yīng)選取菌落數(shù)在5～50個(gè)范圍之內(nèi)的平皿計(jì)數(shù)，乘以稀釋倍數(shù)后，即為每g(或每mL)檢樣中所含的霉菌和酵母菌數(shù)。其它范圍內(nèi)的菌落數(shù)報(bào)告應(yīng)參照菌落總數(shù)的報(bào)告方法報(bào)告之。

5.4  每g(或每mL)化妝品含霉菌和酵母菌數(shù)以CFU/g(mL)表示。